文章引用曲博士豬群健康管理公眾號(hào)，通過(guò)問(wèn)答的形式，和大家一起學(xué)習(xí)關(guān)于實(shí)驗(yàn)室熒光定量PCR的基本知識(shí)。
問(wèn)題1：PT-PCR、qPCR、Real- time PCR、real-time PR-PCR有什么區(qū)別？ ⑴ RT-PCR是逆轉(zhuǎn)錄 PCR，是普通PCR的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA，再以此為模板通過(guò)PCR進(jìn)行 DNA擴(kuò)增。 ⑵ Real-time PCR和 qPCR是一樣的，都是實(shí)時(shí)定量PCR，指的是PCR過(guò)程中每個(gè)循環(huán)都有數(shù)據(jù)的實(shí)時(shí)記錄，因此可以對(duì)起始模板數(shù)量進(jìn)行精確的分析。 ⑶ Real-time PCR和 RT-PCR看起來(lái)都可以縮寫為RT-PCR，但是國(guó)際上普遍認(rèn)為RT-PCR特指反轉(zhuǎn)錄PCR，而Real-time PCR一般縮寫為 qPCR。 ⑷ Real-time RT-PCR（RT-qPCR）， 就是結(jié)合了熒光定量技術(shù)的反轉(zhuǎn)錄PCR：先從 RNA 反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA（RT），然后再用 Real-time PCR進(jìn)行定量分析（qPCR）。 問(wèn)題2：什么是擴(kuò)增曲線？ 擴(kuò)增曲線是指PCR過(guò)程中，以循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)過(guò)程中實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)所做的曲線。 問(wèn)題3：什么是基線（Baseline）？ 基線是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個(gè)循環(huán)里，熒光信號(hào)變化不大。接近一條直線，這樣的直線即是基線。 問(wèn)題4：熒光域值（threshold）怎么設(shè)定？ 一般將 PCR反應(yīng)前 15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光域值是PCR 3~15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，熒光域值設(shè)定在 PCR擴(kuò)增的指數(shù)期。 一般來(lái)說(shuō)，每臺(tái)儀器在使用前都已經(jīng)設(shè)置好了熒光閾值。 問(wèn)題5：什么是CT值？ CT值表示每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CT值越小，反之亦然。 利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)難曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)。縱坐標(biāo)代表CT值。因此，只要獲得未知樣品的CT值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 問(wèn)題6：什么樣的擴(kuò)增曲線是正常的？ 可以從以下4個(gè)方面評(píng)估： ⑴ 曲線拐點(diǎn)清楚，特別是低濃度樣本指數(shù)期明顯，擴(kuò)增曲線整體平行性好。 ⑵ 曲線指數(shù)期斜率與擴(kuò)增效率成正比，斜率越大擴(kuò)增效率越高。 ⑶ 標(biāo)準(zhǔn)的基線平直或略微下降，無(wú)明顯的上揚(yáng)趨勢(shì)。 ⑷ 各管的擴(kuò)增曲線平行性好，表明各反應(yīng)管的擴(kuò)增效率相近。 問(wèn)題7：什么是熔解曲線？ 對(duì)PCR產(chǎn)物加熱，隨著溫度的升高，雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物逐漸解鏈，DNA雙鏈逐漸解鏈為單鏈，嵌入到雙鏈中的熒光染料分子也會(huì)逐漸脫落下來(lái)，熒光信號(hào)強(qiáng)度逐漸下降。 在某段溫度時(shí)，雙鏈迅速而大量地解鏈，熒光信號(hào)強(qiáng)度驟然下降，在這段溫度中，一半的雙鏈解鏈的溫度我們稱為熔解溫度（即Tm值）。 最終DNA雙鏈完全解鏈為單鏈，熒光值下降為一個(gè)本底水平。這一整體過(guò)程中的熒光信號(hào)隨溫度變化的曲線就是熔解曲線，稱為原始圖譜。該圖譜做負(fù)導(dǎo)數(shù)換算后得到熔解曲線的導(dǎo)數(shù)圖譜，導(dǎo)數(shù)圖譜會(huì)出現(xiàn)熔解峰，熔解峰對(duì)應(yīng)的溫度就是Tm值。 問(wèn)題8：熔解曲線如何解讀？ ⑴ 如果在80℃-90℃之間出現(xiàn)唯一主峰，說(shuō)明熒光定量PCR完美； ⑵ 如果在80℃-90℃之間出現(xiàn)主峰，80℃以下出現(xiàn)雜峰，基本考慮引物二聚體，可嘗試提高退火溫度解決； ⑶ 如果在80℃-90℃之間出現(xiàn)主峰，溫度上升又出現(xiàn)雜峰，基本上考慮有DNA污染，需要在實(shí)驗(yàn)初始階段去除DNA。 問(wèn)題9：如何繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線？ 將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至不同濃度，作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以測(cè)得的CT值作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 對(duì)未知樣品進(jìn)行定量時(shí)，根據(jù)未知樣本的CT值，即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到樣品的拷貝數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線在絕對(duì)定量的時(shí)候非常重要。
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