2024年10月10日，蘭州獸醫(yī)研究所郭慧琛團(tuán)隊(duì)在Nature Communications發(fā)表題為“Foot-and-mouth disease virus antigenic landscape and reduced immunogenicity elucidated in atomic detail”的研究論文。利用冷凍電鏡結(jié)合大動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)、病毒中和性噬斑減少實(shí)驗(yàn)、液相阻斷ELISA試驗(yàn)等揭示了口蹄疫病毒(FMDV)從完整146S解離到12S后免疫效力顯著降低的具體機(jī)制。該研究揭示了原子分辨率下病毒抗原性變化的特征，解決了FMD研究中長期懸而未決的問題，擴(kuò)展了對FMDV抗原表位分布和抗體反應(yīng)的全面理解，是FMDV結(jié)構(gòu)和抗原性研究方面極為重要的突破。將為基于結(jié)構(gòu)的FMD新型多價(jià)廣譜疫苗的設(shè)計(jì)提供有價(jià)值的指導(dǎo)。
FMD是一種對偶蹄動(dòng)物具有高度傳染性的疾病，其病原為FMDV，包含七種血清型(O、A、C、Asia 1、SAT 1–3)，每種血清型都有多個(gè)不斷進(jìn)化的亞型且血清型之間沒有交叉保護(hù)。成熟的病毒粒子（146S）由一個(gè)二十面體衣殼包裹正義RNA基因組構(gòu)成。病毒衣殼由60個(gè)原體組裝形成，每個(gè)原體包含一個(gè)病毒衣殼蛋白VP1、VP2和VP3的單拷貝，以及一個(gè)內(nèi)部的VP4蛋白。與其他小RNA病毒不同，完整的FMDV衣殼很容易在暴露于微熱(56°C)或酸性pH值(pH<6.5)時(shí)，降解為缺乏VP4的12S五聚體顆粒和不可溶的VP4聚集物。
傳統(tǒng)的FMD疫苗以滅活的FMDV為抗原。完整146S的疫苗效力比12S高45至400倍；T細(xì)胞反應(yīng)也依賴于完整的146S并協(xié)助誘導(dǎo)中和抗體。這種免疫原性的差異與146S和12S間均具有多個(gè)表位的保守性相矛盾。盡管FMDV與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用已被廣泛研究，但12S在誘導(dǎo)保護(hù)性抗體方面效率較低的分子基礎(chǔ)一直無法解釋。為了研究146S和12S抗原性和免疫原性的差異，該研究首先解析了12S（3.2 ?）及其與靶向病毒粒子內(nèi)部的單域抗體M3F免疫復(fù)合物（3.2 ?）的高分辨率結(jié)構(gòu)。這是首次報(bào)道的小RNA病毒五聚體的高分辨率結(jié)構(gòu)，也是首次通過結(jié)構(gòu)解析觀察到的抗體靶向小RNA病毒衣殼內(nèi)部的研究。結(jié)果顯示，解離后的五聚體表現(xiàn)出顯著增加的曲率，頂部（結(jié)構(gòu)蛋白VP1）更向外突出，邊緣（結(jié)構(gòu)蛋白VP2和VP3）更向內(nèi)凹陷，可能是由于原本146S球面結(jié)構(gòu)裂解導(dǎo)致亞單位12S缺乏幾何約束。在裂解產(chǎn)生的12S中觀察到，VP1和VP2 N端明顯的大規(guī)模無序，并伴隨VP4的丟失。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步解析了146S與兩種不同的146S特異性單域抗體（M678F和M688F）的復(fù)合物的高分辨率結(jié)構(gòu)，確定M678F和M688F分別結(jié)合在靠近3次軸和5次軸頂點(diǎn)的位置，阻礙了VP1中RGD序列與整合素的相互作用。兩個(gè)單域抗體采用不同的、與146S結(jié)合的特異性機(jī)制，M678F通過在3次軸處跨越兩個(gè)相鄰的五聚體來實(shí)現(xiàn)與146S的結(jié)合特異性。而M688F通過在5次軸頂點(diǎn)處跨越兩個(gè)相鄰的原體5S來實(shí)現(xiàn)與146S的結(jié)合特異性，該構(gòu)象表位中因146S的解離導(dǎo)致曲率增加，改變了這些原體在5倍頂點(diǎn)處的距離。兩種抗體通過穩(wěn)定146S顆粒結(jié)構(gòu)、產(chǎn)生RGD與整合素之間的空間位阻，實(shí)現(xiàn)對病毒中和效果，而且，兩種抗體的協(xié)同中和效力比自身單獨(dú)中和作用強(qiáng)50倍左右。
該研究還通過測量病毒表面表位之間的距離，并使用該研究解析的結(jié)構(gòu)和已發(fā)表的FMDV 13個(gè)抗體復(fù)合物3D結(jié)構(gòu)的聚類分析，重新繪制了146S的抗原位點(diǎn)圖譜。新繪制的結(jié)構(gòu)位點(diǎn)包括通過逃逸突變分析鑒定的已知抗原表位，并提示存在潛在的新抗原位點(diǎn)，可供后續(xù)研究。一些先前確定的5個(gè)抗原位點(diǎn)與該研究中指定的四類抗原位點(diǎn)相關(guān)。位點(diǎn)1主要是線性的且對胰蛋白酶敏感，包含VP1的GH環(huán)和C端，相當(dāng)于該研究中的II類位點(diǎn)。除位點(diǎn)5外，位點(diǎn)2-5均為構(gòu)象位點(diǎn)且對胰蛋白酶具有抗性。該研究不支持將位點(diǎn)1和5分開分類，這兩個(gè)位點(diǎn)都涉及 VP1的GH環(huán)。但是，位點(diǎn) 2、3和4分別對應(yīng)于研究中的III、I和IV類位點(diǎn)?；诮Y(jié)構(gòu)的位點(diǎn)分類還允許將非中和抗原位點(diǎn)映射到V類位點(diǎn)，而這是利用逃逸突變實(shí)驗(yàn)不能測定的。研究中基于結(jié)構(gòu)的分類還可以分析針對血清中不同類別的單個(gè)表位的抗體反應(yīng)，并顯示使用146S和12S免疫誘導(dǎo)不同的抗體譜系。
在該研究中，用等劑量的12S和146S免疫兩組豬后，12S組和146S組之間的總FMDV特異性抗體反應(yīng)水平相似，表明12S效力降低不太可能歸因于與146S之間顆粒大小的差異。通過比較146S和12S在豬體內(nèi)的免疫原性，例如引起中和抗體效力差異和基于結(jié)構(gòu)分類的五類抗體水平的差異，并結(jié)合結(jié)構(gòu)抗原位點(diǎn)圖譜的分析，發(fā)現(xiàn)146S的解離引發(fā)多種表位的結(jié)構(gòu)改變和破壞，從而導(dǎo)致12S與146S誘導(dǎo)的抗體譜系顯著不同，并顯著削弱了12S的疫苗中和效力。由此確定了在以往的研究中，針對FMDV單個(gè)抗原表位和肽疫苗在靶動(dòng)物中表現(xiàn)出不太理想的保護(hù)效果的原因。研究最后提示，由于146S獨(dú)有的中和表位促進(jìn)了FMDV特異的體液免疫，因此針對這些獨(dú)特中和表位的雞尾酒設(shè)計(jì)，可以在FMDV暴發(fā)期間用于緊急免疫疫苗的研發(fā)。
中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所孫世琪研究員、郭慧琛研究員和中國科學(xué)院生物物理所王祥喜研究員為論文的通訊作者，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所博士生李昊洲、董虎博士和中國科學(xué)院生物物理所博士生劉攀為論文第一作者。
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-53027-5?utm_source=rct_congratemailt&utm_medium=email&utm_campaign=oa_20241010&utm_content=10.1038/s41467-024-53027-5
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